编者按：这篇文章由病原体进化/基因组学领域的一些主要研究人员撰写，发表在病毒学论坛上，原本的主题是病毒的核酸序列分析和其起源模型推测，并非全篇在针对阴谋论驳斥，但因其在起源推测部分给出了“为何不可能是人工造病毒”的确切理由和推断论据，为SARS-CoV-2不是实验室构建物，也不是一种故意操纵的病毒提供了证据。

该文作者推测新冠病毒主要是经过1) 非人动物病毒通过自然选择成为人畜共感染病毒；2) 人畜共感染后在人类之间传播时自然选择这两个过程后诞生。

SARS-CoV-2的最初起源

自从中国湖北省武汉市首次报告了一种新型肺炎(covid-19)以来，关于致病病毒SARS-CoV-2的起源一直存在相当多的讨论和不确定性。

SARS-CoV-2感染现在在中国很普遍，每个省份都有病例。截至2020年2月14日，已确认64,473例此类病例，其中1,384例死亡归因于该病毒。这些官方病例数字可能被低估了，因为对轻度和无症状病例的报告有限，而且该病毒显然能够有效地人际传播。

基于向卫生保健系统较薄弱的国家传播的可能性，世界卫生组织已宣布19日爆发的covid-19为国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)。目前还没有针对这种疾病的疫苗或特定治疗方法。

SARS-CoV-2是已知感染人类的第7种冠状病毒。其中三种病毒是SARS CoV-1、MERS和SARS- cov -2，可导致严重疾病；另外四种是HKU1、NL63、OC43和229E，与轻度呼吸道症状相关。

在此，我们回顾了可以从现有的基因组序列数据的比较分析中推断出的SARS-CoV-2的起源和早期进化。

特别地，我们提供了一个关于SARS-CoV-2基因组显著特征的观点，并讨论了这些特征可能出现的场景。重要的是，这项分析提供了证据，证明SARS-CoV-2不是实验室构建物，也不是一种故意操纵的病毒。

下面描述的alpha-和beta冠状病毒(科冠状病毒科)的基因组比较确定了SARS-CoV-2基因组的两个显著特征：(i)基于结构建模和早期生化实验，SARS-CoV-2似乎最适合与人类ACE2受体结合;(ii) SARS-CoV-2的高度可变的spike (S)蛋白通过插入12个核苷酸在S1和S2边界处有一个多碱性(furin)裂解位点。此外，这一事件导致了三个预测的o型链聚糖周围的多碱性切割位点。

SARS-CoV-2受体结合区域的突变

SARS-CoV和Sars相关冠状病毒穗状蛋白中的受体结合域(RBD)是病毒基因组中最易变的部分。RBD中的六个残基对与人类ACE2受体结合和确定宿主范围至关重要。

使用基于SARS-CoV的Urbani应变的坐标，它们是Y442、L472、N479、D480、T487和Y4911。SARS-CoV-2中相应的残基为L455、F486、Q493、S494、N501、Y505。这6个残基中有5个在SARS-CoV-2中发生了突变，而与之最接近的病毒RaTG13是从一种叫Rhinolophus affinis的蝙蝠中取样的，其与该病毒的相似度约为96%(图1a)。



图1所示：(a) SARS-CoV-2穗状蛋白接触残基突变。SARS-CoV-2 (top)的穗状蛋白与最接近的类似于sars的CoVs和SARS-CoV-1的蛋白是一致的。在SARS-CoV-2和SARS-CoV Urbani株中，与ACE2受体接触的穗蛋白中的关键残基都用蓝色方框标记。(b)多碱解理位点和o型链聚糖的获取。多碱解理位点用灰色标记，相邻的三个预测o型链聚糖用蓝色标记。多碱性解理位点和o型链聚糖都是SARS-CoV-2所特有的，以前从未在B系betacoronaviruses中发现。显示的序列来自NCBI GenBank，登录号MN908947、MN996532、AY278741、KY417146、MK211376。穿山甲冠状病毒序列来自SRR10168377和SRR10168378 (NCBI生物工程PRJNA573298)18,19。

根据模型1和生化实验3、4,SARS-CoV-2似乎有一个RBD，它可能与来自人类、非人类灵长类动物、雪貂、猪和猫，以及其他高受体同源物种的ACE2具有高亲和力。相比之下，SARS-CoV-2在其他与sars类病毒相关的物种(包括啮齿动物和果子狸)中与ACE2的结合效率较低。

SARS-CoV-2 S蛋白中486残基处的苯丙氨酸(F)与SARS-CoV Urbani株中的L472相对应。值得注意的是，在SARS-CoV细胞培养实验中，L472突变为苯丙氨酸(L472F)5，这被认为是SARS-CoV RBD与人类ACE2受体6结合的最佳选择。

然而，这种位置的苯丙氨酸也存在于几个来自蝙蝠的类似sars的cov中(图1a)。虽然这些分析表明，SARS-CoV-2可能能够与人类ACE2受体结合，具有很高的亲和力，但这种相互作用并不被认为是最佳的。

此外，SARS-CoV-2 RBD中的几个关键残基与之前描述的人类ACE2受体结合的最佳残基不同。与这些计算预测相反，最近的结合研究表明，SARS-CoV-2与人类ACE27具有很高的亲和力。因此，SARS-CoV-2峰似乎是人类或类人ACE2选择的结果，这里的“峰”可以改变刺突蛋白或者S蛋白，允许另一个优化结合解决方案出现。这有力地证明了SARS-CoV-2不是基因工程的产物。

多碱解理位点和o型链聚糖

新型冠状病毒的第2个显著特征是在S蛋白的2个亚基S1/S2的交界处Furin蛋白酶切割位点（RRAR）。除了两个碱性精氨酸和一个在切割位点的丙氨酸外，还插入了一个脯氨酸。

由脯氨酸插入产生的转角结构会导致在Furin蛋白酶切割位点侧翼的S673，T678和S686发生添加O末端糖基化。以前的β冠状病毒均无Furin蛋白酶切割位点，所以这是新型冠状病毒的十分独特的特征。一些人类β-冠状病毒，包括HCoV-HKU1（谱系A），具有多碱基切割位点，以及在S1 / S2切割位点附近的O端糖基化。

尽管SARS-CoV-2中多碱基切割位点的功能后果尚不清楚，但SARS-CoV的实验表明，在S1 / S2交界处突变出这样的位点可增强细胞-细胞融合，但不影响病毒进入。

多碱性裂解位点可被呋喃和其他蛋白酶有效裂解，并可在禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的两个亚基的交界处获得，条件是选择病毒的快速复制和传播(如高度密集的鸡群)。HA与冠状病毒S蛋白在细胞-细胞融合和病毒进入过程中起类似的作用。通过插入或重组获得血凝素的多碱性裂解位点，可将低致病性禽流感病毒转化为高致病性病毒。流感病毒HA在细胞培养或动物中重复强迫传代后也观察到多碱性裂解位点的获取。

同样，新城疫病毒的一株无毒分离株通过在其融合蛋白亚单位的连接处逐步获得多碱基裂解位点，在鸡的连续传播过程中成为高致病性病毒。这三种预测的o型链聚糖的潜在功能尚不清楚，但它们可以创造一个“黏液样结构域”，保护潜在的表位或SARS-CoV-2峰蛋白上的关键残基。需要进行生化分析或结构研究来确定预测的o型链聚糖位点是否被利用。

SARS-CoV-2起源的理论

SARS-CoV-2不太可能是通过对现有sars相关冠状病毒的实验室操作而出现的。如上所述，SARS-CoV-2的RBD是针对人类ACE2受体与不同于预期的高效结合解决方案结合而优化的。

此外，如果已经进行了基因操作，人们就会期望能够使用能够治疗冠状病毒的几种反向基因系统中的一种。然而，情况并非如此，因为遗传数据显示，SARS-CoV-2并非源自任何以前使用过的病毒主链。

相反，我们提出了两种可能解释SARS-CoV-2起源的方案:(1)人畜共患病转移前非人类动物宿主的自然选择;(2)人畜共患病转移后人类的自然选择。我们还讨论了在培养过程中的选择是否会产生相同的观察到的特征。

动物宿主的选择。由于早期的Covid-19病例多与武汉的华南海鲜和野生动物市场有关，所以该地区可能存在动物来源。考虑到SARS-CoV-2与蝙蝠类Sars - cov(尤其是RaTG13)的相似性，蝙蝠充当SARS-CoV-2的宿主似乎是合理的。

然而，重要的是要注意到，以前在人类中爆发的冠状病毒涉及直接接触蝙蝠以外的动物，包括果子狸(SARS)和骆驼(MERS)，它们携带的病毒在遗传上分别与SARS- cov -1或MERS- cov非常相似。通过类比，与SARS-Cov-2密切相关的病毒可能在一个或多个动物物种中传播。

初步分析表明，非法输入广东省的马来亚穿山甲含有一种与SARS-CoV-218相似的冠状病毒。在整个基因组中仍然相对于SARS-CoV-2最接近，但马来亚穿山甲CoV在所有六个关键RBD残基上均与SARS-CoV-2相同（图1）。

然而，尚未鉴定出在整个基因组中都与SARS-CoV-2足够相似的穿山甲CoV，以支持直接人类感染。另外，穿山甲冠状病毒不携带Furin蛋白酶切割位点。为了使前体病毒获得适合于人ACE2受体结合的多价裂解位点和刺突蛋白中的突变，动物宿主可能必须具有较高的种群密度才能有效地进行自然选择，并且还需要有一个ACE2基因，类似于人类直系同源物。所以下一步的公共卫生重点应该是进一步寻找穿山甲和其他动物中可能带有SARS-CoV样病毒的CoV表征。

对人类的神秘适应也有可能，SARS-CoV-2的祖先从非人类的动物跳到人类，而上述基因组特征是在随后的人传人过程中通过适应而获得的。我们推测，一旦获得这些适应性(一起或串联)，就能使疫情迅速爆发，产生足够大且不寻常的肺炎病例群集，从而触发最终发现它的监测系统。

到目前为止，所有的SARS-CoV-2基因组序列都具有适应良好的RBD和多碱基切割位点，因此它们都来自具有这些特征的共同祖先。在穿山甲中发现的RBD与SARS-CoV-2中的RBD非常相似，这意味着这种RBD很可能已经存在于跳到人类身上的病毒中，即使我们还没有确切的非人类祖先病毒。这使得多碱性解理位点的插入在人际传播过程中发生。以甲型流感病毒HA基因为例，需要特定的插入或重组事件才能使SARS-CoV-2作为流行病原体出现。

利用现有的基因组序列数据估计SARS-CoV-2最近的共同祖先(tMRCA)的时间点是在201920年11月下旬到12月初，与最早的回顾性确诊病例相符。因此，这种情况假定在最初的人畜共患病转移事件和获得多碱性切割位点之间存在一段未被识别的人类传播期。如果之前有许多人畜共患病事件在较长时间内产生短的人际传播链(所谓的“口吃链”)，那么就有足够的机会出现。

这基本上就是阿拉伯半岛的MERS-CoV的情况，在那里所有的人间病例都是单峰驼病毒重复跳跃的结果，产生单一感染或短链传播，最终得到解决。到目前为止，经过8年的2499个病例，还没有出现人类适应的情况，使MERS-CoV在人类中流行起来。

我们如何测试SARS-CoV-2的隐性传播是否能使人类适应?储存血清样本的宏基因组学研究可以提供重要信息，但考虑到病毒血症的时间相对较短，可能无法在历史样本中检测到低水平的SARS-CoV-2循环。回顾性血清学研究可能是有益的，这样的研究已经进行了一些。

一项发现显示，动物进口贸易商对冠状病毒的血清阳性率为13％，而另一个研究则发现，中国南方一个村庄的居民对这些病毒的血清阳性率为3％。有趣的是，武汉的200名居民没有显示冠状病毒的血清反应活性。然而，至关重要的是，这些研究无法区分阳性血清反应是由于先前感染了SARS-CoV-1还是感染了SARS-CoV-2。有必要进行进一步的回顾性血清学研究，以确定先前人类在不同地理区域接触过β-冠状病毒的程度，尤其应使用可以区分多种β-冠状病毒的测定方法。

在通道选择。在细胞培养和/或动物模型中通过类似于蝙蝠sars的冠状病毒的基础研究已经在BSL-2的多个实验室中进行了多年，时间跨度为25-28年。也有在BSL-2容器下工作的实验室人员获得SARS-CoV-1的记录实例。因此，我们必须考虑故意或无意释放SARS-CoV-2的可能性。

从理论上讲，SARS-CoV-2在细胞培养中适应传代过程中可能获得了观察到的RBD突变位点，正如在对SARS-CoV5和MERS-CoV31的研究中所观察到的那样。然而，获取多碱性卵裂位点或o型链聚糖(如果有功能的话)则与此相反。低致病性禽流感病毒在细胞培养或动物体内长时间传代后，才出现新的多碱性裂解位点。

此外，通过细胞培养或动物传代产生SARS-CoV-2需要事先分离具有高度遗传相似性的祖病毒。随后的多碱性裂解位点需要在细胞培养或具有与人类相似的ac -2受体的动物(如雪貂)中进行严格的通道程序。同样值得怀疑的是，o型链聚糖的产生是否发生在细胞培养过程中，因为这种突变通常意味着免疫系统的参与，而这在体外是不存在的。

结论

在COVID-19列为全球突发的公共卫生事件的情况下，人们有理由怀疑这一流行病的起源为何如此重要。
详细了解一种动物病毒如何跨越物种界限如此有效地感染人类，将有助于预防未来的人畜共患病事件。例如，如果SARS-CoV-2在另一种动物物种中预先适应，那么即使当前的疫情得到控制，我们仍面临未来再次出现疫情的风险。
相反，如果我们描述的适应过程发生在人类身上，那么即使我们重复了人畜共患病转移，它们也不太可能发生，除非发生相同的一系列突变。此外，确定与SARS-CoV-2亲缘关系最近的动物将大大有助于病毒功能的研究。事实上，RaTG13 bat序列的可用性促进了在这里进行的比较基因组分析，有助于揭示RBD中的关键突变以及多碱基切割位点的插入

这里描述的基因组特征可能部分解释了SARS-CoV-2在人类中的传染性和遗传性。虽然基因组学证据不支持SARS-CoV-2是实验室构建的观点，但目前还无法证明或反驳这里描述的其他关于其起源的理论，而且不清楚未来的数据是否有助于解决这个问题。确定直接的非人类动物来源并从中获得病毒序列将是揭示病毒来源的最确定方法。

此外，这将有助于获得更多关于该病毒的遗传和功能数据，包括受体结合的实验研究、多碱裂解位点的作用和预测o型链聚糖。识别SARS-CoV-2的潜在中间宿主，以及对早期病例(包括那些与武汉市场无关的病例)进行排序，同样会提供大量信息。无论SARS-CoV-2是如何产生的，对人类和其他动物肺炎的持续监测显然是最重要的。

作者：克里斯蒂安·g·安徒生（Kristian G. Andersen），美国加州拉荷亚市斯克里普斯研究所免疫学和微生物学系；美国加州拉荷亚市斯克里普斯转化研究所，邮编92037/安德鲁·兰姆伯特( Andrew Rambaut)，英国爱丁堡大学进化生物学研究所/伊恩·利普金（W. Ian Lipkin），美国纽约哥伦比亚大学梅尔曼公共卫生学院感染与免疫中心/ 爱德华·c·福尔摩斯（Edward C. Holmes），澳大利亚悉尼大学生命与环境科学学院和医学院玛丽·巴希尔传染病和生物安全研究所/罗伯特·f·加里（Robert F. Garry），杜兰大学，医学院，微生物和免疫学系，新奥尔良，洛杉矶，美国；美国马里兰州日耳曼敦LCC Zalgen实验室。

通讯作者:克里斯蒂安·g·安徒生免疫学和微生物学系，斯克里普斯研究所，La Jolla, CA 92037，美国。

我们感谢所有向GISAID数据库(https://www.gisaid.org/ 20)提供了SARS-CoV-2基因组序列的人，并向Virological.org 14 (http://virological.org/ 4)提供了分析和想法。ECH由ARC澳大利亚奖得主奖学金(FL170100022)资助。KGA由NIH资助1U19AI135995-01。AR由威康信托基金(合作者奖206298/Z/17/Z - ARTIC网络)和欧洲研究理事会(批准协议编号:no。725422 - ReservoirDOCS)。

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